加拿大西部奶牛场抗菌素耐药大肠杆菌的One Health比较基因组学评估

抗菌素耐药性是日益严峻的全球公共卫生问题，影响动物、人类和环境。大肠杆菌因其普遍存在性，可能在AMR跨领域传播中发挥关键作用。城郊区域作为城市与农村系统的交汇地带，为AMR控制带来了独特挑战。然而，在加拿大弗雷泽河谷等城郊农业地区，关于AMR沿One Health连续体传播的数据仍然有限。该研究采用One Health方法，评估同一地理区域和时间范围内奶牛生产系统、邻近自然环境与城郊社区大肠杆菌之间AMR特征的关联。研究从人类、动物和环境来源回收大肠杆菌分离株，覆盖One Health全部三个领域，利用全基因组测序评估AMR决定簇（包括耐药基因、质粒和毒力因子）的存在情况，并评价AMR沿One Health连续体传播的潜在风险。

大肠杆菌分离株的来源与季节分布

研究在两年内（2022–2024）从加拿大不列颠哥伦比亚省弗雷泽河谷地区的三个常规和三个有机奶牛场及周边环境季节性采集粪便和环境样本。牛群规模在140至700头之间，三个有机农场在夏季允许奶牛进入牧场，而三个常规农场则将牛群全年圈养在室内。共回收1016株大肠杆菌分离株，其中421株进行全基因组测序。样本来源包括犊牛粪便、泌乳牛粪便、干奶牛粪便、粪池、施肥土壤、地表水、废水进水和废水出水。犊牛粪便中大肠杆菌浓度最高（1.1×10⁸ CFU/g），环境样本中最低（土壤7.94×10² CFU/g，地表水1.28×10⁷ CFU/100 mL）。部分样本类型（干奶牛粪便、粪池、施肥土壤、地表水和废水出水）中大肠杆菌浓度存在显著的季节差异，而犊牛粪便、泌乳牛粪便和废水进水则无显著季节变化。

抗菌素耐药表型与耐药谱

药敏试验显示，82.19%（346/421）的大肠杆菌分离株对全部14种抗菌药物敏感，无分离株对粘菌素或美罗培南耐药。在其余75株耐药分离株中，对四环素和氨苄西林的耐药最为常见，分别占13.06%和10.45%。75株AMR分离株中，72.00%（54/75）对一种以上抗菌药物耐药，其中45.33%（34/75）被归类为MDR。共发现25种不同的耐药谱，其中11种为MDR谱。MDR谱中，对氯霉素、磺胺异噁唑和四环素的耐药最为常见（16.00%），其次为对氨苄西林、磺胺异噁唑、四环素和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑的联合耐药（9株），该谱在所有样本来源中均有发现，但废水进水和出水中除外。犊牛粪便和废水进水样本中耐药表型和MDR的发生率高于其他样本类型。季节对耐药表型或MDR的发生无显著影响。

血清型与序列型的多样性及跨域分布

在421株测序分离株中，共发现211种不同的血清型。最常见的血清型为ONT:H21（n=11）。在15种最常见的血清型中，11种在One Health三个领域中的至少两个领域有分布，动物和环境样本常共享相似血清型。血清型O49:H4仅见于犊牛粪便（n=7），O8:H19仅见于犊牛和干奶牛样本，O153/O178:H7仅见于施肥土壤（n=5）。共鉴定出174种不同的序列型，包括8种新ST（ST18490–18497）。最常见的15种ST涵盖150株分离株，其中13种在至少两个One Health领域中被检出。ST58最为常见（n=25/421；5.94%），在One Health连续体中广泛分布。ST14962（n=7）和ST69（n=7）分别仅在犊牛粪便和废水样本中检出。值得注意的是，O157:H7血清型——与产志贺毒素大肠杆菌相关的重大人类致病血清型——在本次分离株中完全缺失，前6种非O157 STEC血清群中仅10株携带其中一种抗原。

耐药基因、质粒与毒力基因的分布特征

在421株测序分离株中，共发现38种不同的耐药基因，赋予对8种不同抗菌药物类别的耐药性。17.8%（75/421）的分离株携带至少一个耐药基因。最常见的耐药基因为氨基糖苷类耐药基因aph(3')-Ib和aph(6)-Id（40/421），其次为tet(A)（39/421）。7株分离株存在点突变，包括gyrA基因的两个突变和拓扑异构酶IV parC亚基A的三个突变。季节对耐药基因数量无显著影响，而样本来源对耐药基因数量有显著影响。在检测到的38种耐药基因中，9种在One Health三个领域均有分布，13种在动物和人类领域间共享。质粒存在于305/421的分离株中，包含27种不同的复制子类型。大多数分离株仅含1–2个质粒（n=242），IncFIB质粒最为常见（n=230）。质粒数量在不同样本类型间差异显著，地表水分离株质粒数量较少，春季分离株质粒数量显著低于秋季。共鉴定出241种不同的毒力基因（每株23–111个），其中39种为核心毒力组（≥90%分离株中存在），158种在<10%分离株中检出。12种毒素基因在31.83%（134/421）的分离株中被检出，astA最为常见（n=86），其次为cdtA、cdtB和cdtC（n=40）。stx基因变体仅在动物样本（干奶牛粪便和犊牛粪便）中检出，犊牛粪便分离株中毒素基因数量最多（n=67）。

基因组相关性揭示跨域传播的早期证据

成对SNP差异分析显示，在超过88,000个SNP成对比较中，207对分离株（<0.25%）SNP差异≤100，被认为亲缘关系密切。这些密切相关的配对主要（114/207；55.07%）涉及相同样本来源的分离株。约25%（46/207）的密切配对来自不同的One Health领域。其余47对来自不同来源但处于同一One Health领域。总体而言，213株（50.59%）分离株与至少一株其他分离株有密切关系，其中114株（27.08%）与不同样本来源的分离株有至少一个密切关系。值得注意的是，废水进水和出水分离株几乎仅与其他废水分离株亲缘关系密切，仅发现一个废水出水与施肥土壤分离株之间的密切遗传联系（92 SNP差异）。

β-内酰胺耐药分离株的基因组特征

在421株分离株中，40株（所有样本类型中均有）携带至少一种β-内酰胺耐药基因，包括blaCMY-2、blaCTX-M-15、blaCTX-M-27、blaCTX-M-55、blaCTX-M-99、blaTEM-1A或blaTEM-1B，其中blaTEM-1B最为常见。携带β-内酰胺耐药基因的分离株常从废水进水（n=11）中回收，而仅一株粪池分离株携带β-内酰胺耐药基因。这些分离株的ST和血清型多样，共鉴定出20种不同的ST，以ST642和ST69最为常见。ST69仅在人类废水样本中回收。超过半数（65%；26/40）的分离株为MDR。40株β-内酰胺耐药分离株中，6种毒素基因被检出，包括astA、cdtA、cdtC、cdtB、sat和senB。系统发育比较显示，废水分离株倾向于独立于乳制品和环境分离株聚类。在780个SNP成对组合中，19对分离株差异≤100 SNPs，其中4对为干奶牛分离株与施肥土壤分离株之间的配对。在β-内酰胺耐药基因中，blaCTX-M-15、blaCTX-M-27、blaCTX-M-55和blaCTX-M-99被归类为ESBLs，仅10株携带真正的ESBL基因。这些ESBL分离株在One Health所有领域中被检出，其中blaCTX-M-55和blaCTX-M-27在废水和牛分离株中均有发现，且同一来源的分离株表现出密切的基因组亲缘关系。

研究意义与展望

本研究通过One Health比较基因组学方法，系统评估了加拿大西部城郊奶牛场区域抗菌素耐药大肠杆菌的分布与传播。尽管AMR总体水平较低，但高风险谱系和ESBL产生菌在One Health三个领域中的存在表明跨域传播虽有限但确实可能发生，凸显了前瞻性One Health监测和干预的重要性。研究还强调了将环境来源与人类和动物群体一并纳入监测的价值，因为这可以揭示原本无法检测到的储存库和早期传播途径。针对关键牛生命阶段的干预措施（如干奶期管理）以及加强废水和农场生物安全措施，结合扩展的基因组监测，为防止AMR在广泛传播之前出现和扩散提供了战略性途径。

文献链接：https://doi.org/10.1128/aem.01905-25