冻干CRISPR微流控平台让食源性病原菌检测走出实验室

食源性病原菌是影响食品安全的重要风险因素。蜡样芽胞杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌 O157 等均可通过受污染食品进入人体。传统培养方法虽然可靠，但检测周期较长；PCR具有较高灵敏度，却通常依赖专业仪器和实验室条件。因此，如何实现快速、灵敏且适用于现场的多种病原菌检测，一直是食品微生物检测领域的重要研究方向。
       2025年，研究人员在 Advanced Science 发表题为 Enhanced One-Pot Dual-CRISPR-Based Assay Lyophilized on a 3D-Printed Disc for Field-Deployable Multiplex Bacteria Detection 的研究论文，开发了一种结合 RPA扩增、双CRISPR/Cas12a识别、试剂冻干和3D打印微流控芯片 的便携式多重病原菌检测平台。
       传统CRISPR检测通常需要先扩增目标DNA，再进行Cas蛋白检测，不仅步骤较多，还容易因开盖造成扩增产物污染。研究团队构建了增强型一锅式双CRISPR体系——EOD-CRISPR，将解旋酶辅助RPA与两个方向的uAsCas12a-crRNA复合物整合在同一个反应体系中，使核酸扩增和CRISPR信号检测可以在 42 ℃ 条件下同步进行。
       为了进一步提高检测效率，研究人员对反应体系进行了优化。加入BSA后可明显增强阳性与阴性样品之间的荧光差异；同时利用gp41解旋酶促进DNA解链和扩增，并采用活性更高的uAsCas12a，提高CRISPR切割效率。优化后的体系能够在较短时间内产生明显荧光信号。
       该方法进一步用于检测4种常见食源性病原菌，分别以 murB、invA、nuc 和 rfbE 作为蜡样芽胞杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157的检测靶标。反应20 min后，其菌液检测限分别约为 10²、10²、10¹和10¹ CFU/mL，且不同病原菌之间未出现明显交叉反应。
       为了实现多靶标同时检测，研究团队设计了一种 3D打印微流控圆盘。不同反应区域预装针对不同病原菌的CRISPR体系，样品加入后通过离心驱动进入各反应室，从而可以在同一张圆盘上同时完成4种病原菌检测。
       此外，研究人员还将检测体系进行冻干，并利用玻璃纤维膜固定试剂，提高试剂储存和运输稳定性。最终，该平台整合了DNA提取、恒温扩增、CRISPR检测以及便携式荧光读数，从样品处理到结果输出全过程可控制在 48 min以内。并在多种食品基质的加标实验中，该系统均表现出较好的检测灵敏度和特异性。
       这项研究展示了病原菌检测从实验室大型仪器逐步向快速化、多重化和现场化发展的新趋势，也为食品生产现场的快速筛查提供了新的技术思路。