7 CFU/200 μL检出沙门氏菌：重力驱动微流控芯片30分钟完成比色筛查

沙门氏菌是食品安全监测中需要重点关注的食源性致病菌之一。传统培养法结果可靠，但通常需要较长培养时间；分子检测和免疫分析灵敏度较高，却往往依赖仪器、外接动力或较复杂的操作流程。对于基层筛查、现场抽检和供应链快速放行，更理想的方案应尽量减少泵、阀、电源和大型读数设备，同时保留足够的灵敏度和抗基质干扰能力。

本研究围绕这一需求设计了重力驱动微流控比色平台。检测思路是先利用抗体修饰磁珠捕获沙门氏菌，再用抗体修饰Fe-N-C纳米酶标记目标菌，形成磁珠-细菌-纳米酶夹心复合物。复合物被芯片内预置磁体富集并洗涤后，Fe-N-C纳米酶催化TMB-H2O2底物生成蓝色产物，最后通过图像颜色饱和度实现定量读数。整个流程把富集、分离、洗涤、反应和读数串联在芯片上，核心动力来自液体自身重力，而不是外接泵阀。

Fe-N-C纳米酶是该平台的信号放大环节。研究以Fe-ZIF-8为前体，经高温热解形成约150 nm的多孔碳基纳米酶。相比热解前约200-300 nm的多面体前体，Fe-N-C纳米酶表面更粗糙，并形成多孔碳基结构，有利于暴露催化位点。元素分布和结构表征显示，Fe、Zn、C、N在纳米酶中分布较均匀，支持Fe-Nx配位位点的形成。

图1. Fe-N-C纳米酶的稳态动力学评价和催化机制：（a）Fe-N-C纳米酶在H2O2存在下催化TMB氧化的机制；（b）Fe-N-C纳米酶、H2O2-TMB底物及其混合物的吸收光谱；（c）652 nm吸光度与Fe-N-C纳米酶浓度的关系；（d-e）以TMB为底物的Michaelis-Menten动力学分析和Lineweaver-Burk图；（f-g）以H2O2为底物的Michaelis-Menten动力学分析和Lineweaver-Burk图。

催化机制上，TMB可吸附在Fe-N-C表面的吡咯氮位点附近，H2O2则在Fe-Nx活性中心发生类Fenton反应生成羟基自由基，随后氧化TMB形成蓝色oxTMB。实验中，单独的底物或纳米酶几乎不产生明显蓝色信号，二者混合后在652 nm出现特征吸收峰。随着Fe-N-C纳米酶浓度从2.5 μg/mL升至500 μg/mL，吸光度由0.4增至2.3，其中2.5-62.5 μg/mL范围内呈线性响应，说明其可作为比色免疫检测中的放大标签。

芯片部分的关键在于流体控制。研究利用垂直流、选择性流和顺序流三种策略，在3D打印和PDMS成型的芯片中设置样品室、洗涤室、底物室、分离室、废液室、检测室及对应气孔。通过打开或封闭不同气孔，预装溶液可在指定时间进入指定腔室，从而完成复合物释放、磁捕获、废液排出、洗涤、底物释放和产物转移。该设计避免了外置泵阀，但仍需要人工封闭和开启气孔，因此更接近简化现场平台，而不是完全自动化设备。

图2. 微流控芯片的流体控制：（a）垂直流、选择性流和顺序流策略；（b）微流控芯片结构布局；（c）片上细菌检测流程，包括准备、共轭物形成、共轭物释放与捕获、废液释放、洗涤液释放、底物释放与反应，以及产物释放和检测。

为获得较好的检测性能，研究系统优化了磁珠用量、孵育时间、免疫Fe-N-C纳米酶用量和催化时间。磁珠从10 μg增加到40 μg时，捕获效率由78.6%升至96.2%，继续增加到50 μg后提升有限，因此选择40 μg；孵育时间从1 min延长到10 min时，捕获效率由32.7%升至91.3%，15 min时变化不明显，因此选择10 min。免疫Fe-N-C纳米酶用量同样以40 μg为较优条件，催化反应时间则确定为15 min。

图3. 平台检测条件优化：（a）磁珠用量优化；（b）孵育时间优化；（c）免疫Fe-N-C纳米酶用量优化；（d）催化时间优化；（e）颜色饱和度与细菌浓度的关系。数据以平均值±标准差表示，n=3；颜色响应由ImageJ提取产物图像饱和度进行量化。

在优化条件下，平台对200 μL沙门氏菌样品进行三次平行检测。随着细菌浓度从7.4 × 10^1升至7.4 × 10^6 CFU/mL，产物颜色饱和度由105线性增加到237，校准关系为S = 26.38 × lg(C) + 60.38，相关系数R^2为0.98。按约3倍信噪比计算，检出限为7 CFU/200 μL。研究认为，这一性能来自三方面协同：Fe-N-C纳米酶增强比色信号，重力驱动芯片缩短和稳定了片上流程，磁珠免疫捕获则提高了目标菌富集和纯化效率。

真实样品验证使用猪肉加标体系。研究将2.8 × 10^2-2.8 × 10^5 CFU/mL沙门氏菌加入猪肉样品，匀浆5 min并静置15 min后，取上清液进入微流控芯片检测，同时以培养计数作比较。不同浓度下，平台得到的回收率为87%-128%，最大相对标准偏差为7.5%。这一结果说明平台可处理实际肉类基质，但论文也指出，脂肪、蛋白和血液等复杂成分会影响沙门氏菌与磁珠、纳米酶之间的免疫反应，因此基质干扰仍是后续应用需要继续优化的问题。

图4. 平台用于沙门氏菌检测的实际验证和特异性分析：（a）真实食品样品检测流程；（b）特异性分析；（c）实用性分析。数据以平均值±标准差表示，n=3。

特异性测试中，研究比较了10^4 CFU/mL沙门氏菌、10^6 CFU/mL大肠杆菌、10^6 CFU/mL李斯特菌、三种细菌混合物和PBS阴性对照。沙门氏菌组及含沙门氏菌的混合组产生明显更高的颜色饱和度，而非目标菌和阴性对照响应较低，说明抗体识别和磁分离过程具有较好的选择性。进一步的实用性测试让4名技术人员经简单培训后重复检测2.8 × 10^4 CFU/mL目标菌，得到7.4%的人员间标准差和6.7%的人员内标准差，提示操作重复性较好。

总体来看，本研究的亮点不只是低检出限，而是把无外接动力的片上流体控制和纳米酶免疫比色检测结合起来，在30 min内完成食品致病菌筛查。该平台适合被理解为一种面向现场初筛的原型方案：它减少了泵阀和仪器依赖，成本估算约为每片7.2美元，批量生产后有望降至2美元或更低；但其当前仍存在多个手动操作步骤、复杂样品背景干扰和固相纳米酶与液相底物之间催化效率相对有限等问题。后续若能进一步提高自动化程度，并在更多食品基质和更多病原菌上验证，将更有利于向现场检测应用推进。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2026.150050