0.16 pg/mL检出黄曲霉毒素B1：CRISPR/Cas12a纸基电化学传感器实现手机读数

黄曲霉毒素B1是食品安全中长期关注的高风险小分子污染物，常见于玉米、谷物、花生和饲料等农产品中。由于其毒性强、允许限量低，复杂食品基质中微量残留的灵敏检测一直是现场筛查的难点。高效液相色谱和液相色谱-串联质谱等方法能够提供可靠定量结果，但通常依赖大型仪器、样品净化和专业操作，不适合所有基层或现场场景。因此，兼顾灵敏度、便携性、成本和抗干扰能力的检测平台，仍有现实需求。

本研究提出的方案，是把纸基电化学电极、Au@Ti3C2 MXene纳米复合材料和CRISPR/Cas12a分子识别体系整合在一起。传感器表面修饰带有亚甲基蓝信号基团的DNA探针，使其靠近工作电极并产生明显电化学信号。没有目标物时，两条黄曲霉毒素B1适配体与DNA激活子形成稳定的锁定结构，Cas12a-crRNA复合物处于非激活状态；当样品中存在黄曲霉毒素B1时，适配体优先结合目标物并释放激活子，随后激活Cas12a的反式切割活性，使电极表面的DNA探针被切断，亚甲基蓝远离电极，差分脉冲伏安信号随之降低。

图1. CRISPR/Cas12a纸基电化学适配体传感器检测黄曲霉毒素B1的原理示意图。

材料界面的设计是该体系获得高灵敏响应的重要基础。Ti3C2 MXene具有较高导电性、较大比表面积和丰富表面官能团，但片层堆叠会限制活性位点暴露。本研究在Ti3C2 MXene表面原位负载超小金纳米颗粒，形成0D/2D Au@Ti3C2 MXene异质结构。透射电镜显示，金纳米颗粒高密度分布在MXene片层表面，平均粒径约3 nm；高分辨透射电镜、元素映射、X射线衍射和X射线光电子能谱结果共同支持复合材料的成功构建。

电化学表征进一步说明了复合材料的作用。裸工作电极、Ti3C2 MXene修饰电极和Au@Ti3C2 MXene修饰电极的电荷转移电阻分别为314.5 Ω、239.8 Ω和117.6 Ω，Au@Ti3C2 MXene修饰后电阻最低，表明电子传递效率明显提升。循环伏安结果也显示，Au@Ti3C2 MXene修饰电极具有更高的氧化还原峰电流。连续扫描60圈后，修饰电极仍保持较稳定响应；其电化学活性表面积约为0.113 cm2，是裸电极0.047 cm2的约2.4倍。这些结果说明，金纳米颗粒既有助于抑制MXene片层堆叠，也能提供更快的电子传输通道。

图2. Au@Ti3C2 MXene修饰电极的电化学行为：（A）裸工作电极、Ti3C2 MXene和Au@Ti3C2 MXene修饰电极的EIS谱；（B）对应CV谱；（C）不同Au@Ti3C2 MXene浓度下的CV曲线；（D）Au@Ti3C2 MXene修饰电极连续扫描60圈的CV谱；（E）裸工作电极和（F）Au@Ti3C2 MXene修饰电极峰电流与扫描速率平方根的线性关系。

在CRISPR/Cas12a识别模块中，研究使用双适配体调控激活子释放，以降低无目标条件下的背景信号。琼脂糖凝胶电泳显示，两条适配体能够与DNA激活子形成迁移更慢的锁定复合物。荧光验证结果表明，没有黄曲霉毒素B1时，锁定体系维持低信号；加入目标物后，适配体构象变化释放激活子，Cas12a被激活并切割报告探针，荧光明显恢复。与单适配体锁定相比，双适配体体系提供了更稳定的关状态，同时不明显影响目标存在时的开状态，这有助于兼顾低背景和可触发性。

在CRISPR/Cas12a识别模块中，研究使用双适配体调控激活子释放，以降低无目标条件下的背景信号。琼脂糖凝胶电泳显示，两条适配体能够与DNA激活子形成迁移更慢的锁定复合物。荧光验证结果表明，没有黄曲霉毒素B1时体系维持低信号；加入目标物后，适配体释放激活子，Cas12a被激活并切割报告探针，荧光明显恢复。与单适配体锁定相比，双适配体体系更利于兼顾低背景和可触发性。

图3. CRISPR/Cas12a纸基电化学适配体传感器的条件优化与组装验证：（A-C）pH、DNA探针浓度和孵育时间优化；（D）不同修饰步骤的EIS谱；（E）不同修饰步骤的CV谱；（F）便携式检测流程及有无黄曲霉毒素B1条件下的响应对比。

便携性是本研究强调的另一项特点。传感器可与手持式电化学工作站连接，并通过无线方式把数据传输到手机端。实际响应中，目标不存在时亚甲基蓝氧化还原峰电流约为10.43 μA；加入目标物后，峰电流降至2.17 μA，信号下降幅度约79.2%。这一变化说明，CRISPR/Cas12a切割事件能够被纸基电化学界面放大为清晰的电信号差异，为现场快速读数提供了基础。

在定量分析中，研究使用0.5 pg/mL至100 ng/mL的黄曲霉毒素B1标准品进行检测。随着目标物浓度升高，差分脉冲伏安电流信号逐渐降低，峰电流与目标浓度对数之间呈良好线性关系，线性方程为I=-1.46 lgC+5.24，相关系数R2为0.998，检出限为0.16 pg/mL。该检出限低于文中对比的部分已报道传感器，说明Au@Ti3C2 MXene增强界面与CRISPR/Cas12a级联识别的结合，能够提升低浓度黄曲霉毒素B1的响应能力。

特异性测试中，研究把玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素G1、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和酪蛋白作为干扰对象。结果显示，传感器主要对黄曲霉毒素B1及含有黄曲霉毒素B1的混合样品产生明显响应，而干扰物和空白样品的电化学信号接近，提示该双适配体调控CRISPR/Cas12a体系具有较好的目标识别能力。重复性方面，6个独立制备的传感器在相同条件下测试，响应的相对标准偏差为1.2%；稳定性方面，传感器在4 °C连续储存6周后，电流值仍约保留94%。

图4. CRISPR/Cas12a纸基电化学适配体传感器的检测性能：（A）不同黄曲霉毒素B1浓度下的DPV响应；（B）DPV信号与黄曲霉毒素B1浓度对数的相关关系；（C）对非目标干扰组分的特异性评价；（D）传感器重复性；（E）0.5 ng/mL黄曲霉毒素B1条件下6周长期稳定性；（F）实际样品测试散点图。

在实际样品验证中，研究选择玉米、花生、小麦和大米样品进行加标测试，并用HPLC结果进行对照。纸基电化学适配体传感器测得的回收率为93.0%-106.0%，批内相对标准偏差低于3.54%；与HPLC方法相比，差异约在±3.7%以内。对于食品安全检测而言，这些结果支持该平台用于复杂基质中黄曲霉毒素B1的快速筛查和半定量分析。不过，真正用于监管判定时，仍需要结合标准方法复核，并进一步验证不同样品前处理、批间制备一致性和现场环境变化对读数的影响。

总体来看，本研究的贡献在于把低成本纸基电极、导电纳米复合材料和CRISPR/Cas12a分子识别放到同一个便携平台中。Au@Ti3C2 MXene提高了电极界面的电子传递和活性面积，双适配体锁定策略降低了Cas12a误激活背景，手机端读数则增强了现场应用的便利性。该方法为黄曲霉毒素B1快速筛查提供了一个有潜力的工具，也为其他小分子毒素的便携式电化学检测提供了可迁移的设计思路。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2026.148810