不止于检出沙门氏菌：纳米抗体ELISA识别热灭活状态

食品热加工过程中，平板培养可以检测样品中是否还有能够生长的细菌，但是不能反映细胞结构在加热过程中的变化。PCR和LAMP等核酸检测方法具有较快的检测速度，但活菌、死菌和残留DNA都可能产生信号。因此，在检测鼠伤寒沙门氏菌时，除了判断样品中是否存在目标菌，还需要对热处理后细胞的状态进行检测。

本研究以热灭活鼠伤寒沙门氏菌免疫羊驼，利用噬菌体展示技术筛选纳米抗体。热处理会引起细胞蛋白变性和细胞膜结构变化，使部分原来不易被识别的表位暴露出来。根据这一特点，研究筛选能够结合热处理后细胞结构、但不明显结合活菌和甲醛灭活菌的纳米抗体，并将其用于后续检测体系的建立。

图1. 抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体的筛选过程。通过噬菌体ELISA从第三次和第六次免疫后构建的纳米抗体库中筛选候选克隆，并对不同纳米抗体序列进行分析。

 第三次和第六次免疫后构建的抗体库容量分别约为1 × 10^7 pfu和5 × 10^7 pfu。随机挑选克隆进行噬菌体ELISA，两个抗体库的阳性比例均超过50%，第六次免疫库具有较高的阳性率和序列多样性。研究获得10种不同的纳米抗体，其中SR4、SR5、SR6、SR11和S3对活菌和甲醛灭活菌的结合较弱，但可以明显识别热灭活鼠伤寒沙门氏菌。这些纳米抗体识别的可能是热处理后暴露的结构表位。

研究首先建立直接ELISA检测体系。以生物素化SR11作为识别抗体，加入链霉亲和素-多聚辣根过氧化物酶（SA-PolyHRP）进行信号放大，标准曲线相关系数为0.9963，检出限为9.64 × 10^4 CFU/mL。采用常规SA-HRP时，检出限为1.20 × 10^6 CFU/mL，SA-PolyHRP使检测灵敏度提高约12.45倍。直接ELISA的检测步骤较少，但对食品样品中的低浓度污染和复杂基质仍需要进一步提高检测能力。

图2. 基于生物素化纳米抗体和SA-PolyHRP信号放大体系的直接ELISA检测热灭活鼠伤寒沙门氏菌。与常规SA-HRP体系相比，SA-PolyHRP降低了方法的检出限。

在此基础上，研究建立了纳米抗体夹心ELISA。SR6作为捕获抗体，生物素化多克隆抗体作为检测抗体，利用两种抗体的结合完成目标菌捕获和信号放大。优化后，SR6浓度为2 μg/mL，生物素化多克隆抗体浓度为1 μg/mL时，检测体系的线性相关系数为0.9971，检出限为3.53 × 10^3 CFU/mL。与常规SA-HRP夹心ELISA相比，检出限降低约9.06倍；与直接ELISA相比，检出限降低约27.31倍。

图3. 纳米抗体夹心ELISA检测热灭活鼠伤寒沙门氏菌。SR6捕获目标菌，生物素化多克隆抗体进行检测，SA-PolyHRP用于放大检测信号，检出限为3.53 × 10^3 CFU/mL。

 研究还对方法的特异性进行了检测。实验选用了多种沙门氏菌血清型，以及大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌等食源性病原菌。所有菌株经过相同条件热灭活后，夹心ELISA对鼠伤寒沙门氏菌产生明显信号，对其他沙门氏菌和非沙门氏菌病原体没有检测到明显交叉反应。夹心检测中，SR6首先对热处理后的目标结构进行捕获，生物素化多克隆抗体再对鼠伤寒沙门氏菌相关信号进行检测。

图4. 纳米抗体夹心ELISA的特异性检测结果。相同热灭活条件下，该方法对鼠伤寒沙门氏菌响应明显，对其他沙门氏菌血清型和常见食源性病原菌未见明显交叉反应。

 在缓冲蛋白胨水和巴氏杀菌牛奶中进行加标回收实验时，牛奶样品稀释10倍、100倍和1000倍后的回收率分别约为81%至156%、99%至154%和104%至148%。缓冲蛋白胨水中也有部分回收率超过120%。这表明样品基质会对检测信号产生影响，适当稀释可以减小基质干扰。后续富集样品检测采用1:100稀释条件。回收率偏高时，仍需要结合稀释条件和质控结果判断检测误差。

热处理验证实验显示，50 °C处理30分钟后，平板计数仍有约1.60 × 10^9 CFU/mL活菌，ELISA没有检测到明显的热灭活信号。65 °C处理15分钟时，平板计数为约6.60 × 10^8 CFU/mL，ELISA检测到约7.03 × 10^7 CFU/mL热灭活细胞。65 °C处理30分钟后，平板培养未检出可培养菌，但ELISA信号约为3.39 × 10^8 CFU/mL。100 °C和121 °C处理后，ELISA读数分别约为3.38 × 10^9和4.92 × 10^9 CFU/mL，121 °C处理结果接近初始菌量。平板培养结果与ELISA结果的差别，说明细胞失去培养能力和出现明显热诱导结构变化可能不是同时发生的。

该方法主要反映热处理造成的细胞结构变化，不能作为通用的活菌和死菌鉴别方法。平板培养未检出可培养菌时，说明样品中的细胞不能在培养条件下继续生长；ELISA信号升高，则说明热处理后产生了能够被纳米抗体识别的结构变化。将两种检测结果结合，可以用于比较热处理条件和评价灭菌过程。

研究进一步在牛奶、鸡蛋、鸡肉和西兰花样品中进行低剂量污染模拟。每25 g或25 mL样品加入5 CFU鼠伤寒沙门氏菌，经过选择性富集后，ELISA检测结果与平板计数结果总体一致，未加标对照未检出目标菌。不同食品样品的富集速度存在差异，鸡肉样品的细菌增殖速度较慢。多数样品经过5小时适应和12小时选择性富集后，样品浓度可以达到该方法的检测范围。

综上，本研究建立了基于构象敏感纳米抗体的热灭活鼠伤寒沙门氏菌检测方法。夹心ELISA结合SA-PolyHRP信号放大后，检测灵敏度和特异性得到提高，并可用于牛奶、鸡蛋、鸡肉和西兰花等食品样品的富集检测。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2026.148916