突破单模式试纸局限：双模式垂直流芯片同步解析尿液致病菌种类与细菌载量

一、设计原理：纸基垂直流同步鉴定并定量尿液细菌

本文提出了一种分级孔径堆叠的纸基垂直流(VFA)装置，液体受到毛细力的作用从上到下移动。为了避免两种比色反应互相干扰，装置把检测位点在空间上分开，HRP-抗体/TMB免疫检测模块以及WST-8-mPMS代谢定量模块分别加载到不同的检测位点上。检测层使用的是PT-R7复合纤维膜，并且利用梯度孔径吸水叠层来控制液滴停留时间从而增加抗原抗体反应的能力。信号读取用的是手机拍RGB图片，然后转为灰度图来做定量分析。

二、研究内容与结果

1.适配垂直流纸基体系的大肠杆菌特异性免疫比色检测验证

用HRP直接标记抗大肠杆菌LPS抗体，在TSB培养液和尿液基质中分别对5×10⁴~10⁸CFU/mL的大肠杆菌实行特异性检测，以金黄色葡萄球菌为阴性对照。信号强度伴随细菌浓度的增加而增大，几乎没有交叉反应；尿液样本用Hill方程拟合后R²可以到了0.8643，在临床上可以对10⁵CFU/mL菌尿的阈值实行有效的判断。虽然在高浓度时存在一定的信号波动，但是经过手机灰度归一化之后可以消除尿液本底的影响得到浓度依赖的比色响应。此模块可以实现对大肠杆菌的特异识别，并且为之后双模集成装置的菌种鉴定功能打下基础。

2.适配垂直流纸基体系的WST‑8‑mPMS总活菌代谢定量验证

同时使用WST-8-mPMS代谢定量模块来完成不分菌种的总活菌负荷测定。用EDTA使细菌细胞壁暂时变得通透，活菌体内的脱氢酶以mPMS作为电子受体，将WST-8四氮唑盐还原为橙红色的甲臜，比色的深浅就可以折射出样品中总的活菌代谢水平。研究选取大肠杆菌及金黄色葡萄球菌作为实验对象，在TSB培养液以及人尿液这两个基质里利用手机成像灰度转换的方式来实现定量分析。实验结果显示，在活菌浓度增加的时候，灰度值表现单减的趋势，有着较好的浓度响应关系。大肠杆菌在TSB、尿液中的线性拟合R2分别是0.84、0.82；金黄色葡萄球菌在两个基质下的R2也都到了0.72、0.78。本模块不受细菌种类的限制，可以对不同的致病菌实行总的活菌数检测，而且前端滤层可以滤除尿液中的杂质，减少基质的干扰。虽然有关生化反应原理的研究已经存在，但是本项研究将这套代谢检测系统成功地应用到了垂直流纸基平台上，继而为器件实现对总菌负荷的定量给予了重要的技术支持。

3.一体化芯片双模式集成检测验证

目前的纸基垂直流动检测大都只能做一项指标的检测，或者是实行菌种鉴定，或者是实行总菌量测定，不能在同一样本中同时得到致病菌种以及细菌数量两种重要的临床数据。该研究将HRP-抗体/TMB免疫识别和WST-8-mPMS代谢定量这两套比色体系，在一个垂直流纸基芯片中以空间分离的方式集成到一起，然后避免了这两种显色反应之间的化学及光学上的相互影响，并且只需要一份尿样就可以同时实行检测。用添加了大肠杆菌的尿液样本来对集成器件实行性能验证，并且利用手机灰度图片来实行信号读取，整套检测过程在35-40分钟之内就可以得出结果。在代谢模块以及免疫模块都在浓度依赖性响应中，在浓度范围为105CFUmL-1时，代谢模块、免疫模块之间存在统计学差异，可以实现对尿路感染的阈值化筛查。但是原型器件还存在着一些问题，在低细菌浓度的情况下信号变异系数最大可以到了24.82%，信号的不均匀主要是由纸基内部流体分布以及显色区几何缺陷所造成的，可以借助精进亲水图案、控制加样体积等方法来增加检测结果的一致性。

三、结论

本文建立了一种双模式垂直流纸基POCT检测平台来对尿路感染尿液样本实行快速筛查。器件用分级孔径纸基堆叠结构来控制毛细垂直流动，设置了空间上彼此隔离的检测位点，在各个位点上分别集成了HRP-抗体/TMB免疫识别模块及WST-8-mPMS代谢定量模块，并且利用智能手机RGB成像灰度转化来实行定量读取，防止了两种比色体系之间相互影响。模块验证结果表明，免疫模块可特异性识别大肠杆菌，代谢模块不受菌种限制，可对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌完成总活菌负荷定量，在TSB与尿液基质均表现良好线性相关性。集成芯片可利用单份尿液样本，在35‑40 min同时获得菌种鉴定与总菌载量结果，具备临床阈值筛查能力。原型器件仍存在低浓度下信号重复性不足的问题，受纸基流体分布、显色区域几何因素影响。该平台无需大型仪器，为资源受限场景下尿路感染现场初筛提供可行方案，后续仍需优化流体控制并扩大致病菌面板完成进一步临床验证。

原文链接：http://pubs.rsc.org/LC/article-lookup/doi/10.1039/D6LC00265J