拉曼芯片：为血流感染快速药敏检测按下加速键

一、核心技术原理：介电电泳芯片捕获富集活菌

该RamanBioAssay（RBA）平台将介电电泳芯片、无标记拉曼光谱与偏最小二乘（PLS）机器学习算法相结合，以实现阳性血培养样本的快速细菌鉴定与表型抗菌药敏检测的功能。实验过程中，先对血培养样本进行裂解处理，去除血液基质之后再分离获得存活细菌；然后再借助芯片上的负介电电泳效应，在芯片微孔中将细菌快速捕获富集来形成细菌簇。上述过程是无需复杂的样本铺板固定，同时可保留细菌活性的。在药物作用于细菌的过程中，细菌与抗生素仅进行90 min短期共孵育，药物的作用在于使敏感菌与耐药菌产生差异化分子代谢变化，以便采集无标记拉曼光谱从而获取细菌分子指纹。之后对原始光谱执行去尖峰、基线校正、矢量归一化等一系列预处理操作，在此同时计算处理组与未给药生长对照组的差异光谱，最后再通过PLS判别分析模型对光谱特征进行降维挖掘。综上所述，该检测平台的核心在于一方面依据光谱特征完成菌种分类鉴定，另一方面根据光谱差异区分细菌受药物抑制与否来实现表型药敏判读而无需依赖细菌肉眼是否可见生长。整个过程中，从阳性血培养样本起总耗时约3.5 h，可输出临床可用的可用于鉴定的药敏结果。

图1 技术原理图

二、核心实验内容与结果

1.位点选择性电沉积实现适配体空间定向固载以消除检测串扰

本研究首先利用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌这两种标准质控菌株在培养基体系下开展实验。与此同时借助芯片介电电泳效应捕获富集活菌，在细菌经90分钟抗生素短期孵育之后采集无标记拉曼光谱，最后通过PLS偏最小二乘机器学习算法解析光谱指纹以同步实现细菌鉴定与表型药敏判读。结果显示，菌种之间，不同的家族水平分类准确率可达97.2%；在药敏平衡准确率这一维度，经环丙沙星处理后的大肠杆菌的药敏平衡准确率高达94.4%，而苯唑西林处理金黄色葡萄球菌的药敏平衡准确率更是高达100%，并且与参考方法结果的一致性十分良好。在此基础上，研究将进行下一步的开展人工血培养与真实患者血培养的临床可行性验证。

图2 利用 PLS 分析拉曼光谱，实现大肠杆菌、金黄色葡萄球菌区分及两种细菌对应抗生素的快速药敏预测，并与肉汤微量稀释法结果对照。

2.人工血培养拓展至真实患者血培养的临床可行性验证

为从研究首先构建人工血培养模拟样本来模拟临床阳性血培养状态，研究通过裂解缓冲液裂解血细胞、离心分离得到存活病原菌，经90 min抗生素共孵育后上RBA芯片检测，仍然以肉汤微量稀释法作为内部参照。经检测，人工血培养样本检测得到大肠杆菌平衡准确率91.7%，金黄色葡萄球菌为97.2%，证实血液基质处理流程可行，但也观察到分离应激可造成金葡菌部分MIC发生偏移。在此基础上进一步开展真实临床样本测试，纳入6例患者阳性单菌血培养，完成细菌分离后开展RBA检测，并与医院常规的药敏结果比对。数据显示临床样本平均周转时间仅3小时6分钟，显著短于传统药敏。6例样本中4例药敏结果和临床检测相符，1例出现敏感/耐药错配，1例检测结果无结论，证实该平台可直接应用于真实患者血培养，但临床样本存在生物异质性，仍存在一定检测误差。

图3 RamanBioAssay人工血培养物的抗菌药物敏感性测试。

三、结论

本文研发RamanBioAssay（RBA）芯片平台，整合介电电泳细菌富集、无标记拉曼光谱与PLS机器学习算法等关键技术，旨在解决传统血培养药敏检测耗时长、基因检测无法反映表型耐药的临床痛点。无需等待肉眼可见细菌生长，从阳性血培养样本起约3.5小时即可同步完成细菌鉴定与表型药敏检测。研究由简到繁依次开展培养基质控菌株、人工血培养、患者真实血培养三级验证的实验：其关键结果显示培养基条件下菌种分类准确率97.2%，药敏平衡准确率最高达100%；同时人工血培养中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌药敏平衡准确率分别为91.7%、97.2%。6例临床阳性血培养样本平均检测耗时3 h 6 min。上述研究结果研究证实RBA具备快速临床应用潜力，但仍存在MIC偏移、临床样本异质性带来的误差，后续需扩大样本队列、优化实验条件，推动该技术走向临床落地。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6c01690