先分选后培养！代谢驱动单细胞拉曼技术高效捕获窖泥中稀有的高耐乙醇微生物

一、核心技术原理：RACS依据单细胞代谢活性分选窖泥耐乙醇微生物

本项研究建立了氘代水标记单细胞拉曼光谱与拉曼激活细胞分选相结合的技术，并且使用了先分选再培养的方法。在乙醇胁迫的情况下，有代谢活性的窖泥中的微生物可以把氘代水中的氘原子掺入到新形成的生物大分子当中去，在此过程中会产生C-D特征拉曼峰，并且可以利用碳氘比值CDR来定量描述单个细胞的代谢状况。本研究将CDR大于0.08设为分选的标准，在此标准下能够富集出乙醇压力下代谢活性前1%的高耐受性细胞，系统的分选通量达到2400cells/h，分选准确率为91.3%。

经过分选得到的细胞在MRS培养基上生长出六种可以抵抗乙醇的菌株，它们的RTI值都大于50%，能承受8%的乙醇浓度，比传统的培养筛选富集倍数提高了4.5倍。通过基因组学跟转录组学的研究来阐明F4和F5菌株不同的乙醇适应方式。该方法克服了传统的盲筛所存在的缺陷，并且是以单个细胞的代谢特征作为筛选标准，实现在窖泥里找到具有高耐乙醇功能的微生物。

图1 技术原理与工作流程

二、核心实验内容与结果

1.D₂O‑RACS分选大幅提升窖泥高耐乙醇菌株的筛选效率

使用代谢驱动型RACS先分选后培养的方法，在一次操作中就分离出了177个高代谢活性细胞，并从中筛选出六种能够抵抗乙醇的菌种，所有的菌株RTI都大于50%【高耐8%乙醇】；传统的随机分离方法只得到了九种菌株，其中仅有两株是高耐受的。RACS使高耐受菌株富集效率提升4.5倍，评估效率提升6.86倍，RACS分离出的菌株RTI整体上要比传统的筛选组高很多。

图2拉曼激活细胞分选（RACS）分选菌株的上级性能优于常规筛选的分离株情况

2.两株代表菌株F4、F5具有完全不同的乙醇胁迫分子适应策略

对RACS筛选出的两种高耐乙醇代表菌株F4【Lactiplantibacillusplantarum，RTI=85.1±3.41%】和F5【Staphylococcusepidermidis，RTI=62.2±1.09%】进行基因组和转录组分析，发现它们在乙醇胁迫下的分子适应方式完全不同。

在8%的乙醇胁迫条件下，两种菌都出现了大量的基因差异表达现象，但是应激调节途径却存在着明显的差别。F4主要是靠保持发酵代谢稳定来实现耐受性的，其中乳酸脱氢酶基因ldh被大大提高了，并且还调节了乙醇脱氢酶相关的基因，在此过程中重塑了糖酵解，乳酸合成和氨基酸代谢等通路以保证细胞内的氧化还原平衡，在乙醇环境里仍然能够维持基础物质合成以及风味前体物质生成的能力。

但是F5的适应策略是加强细胞膜结构，脂质和甘油合成相关的基因如fabI，gldA，acpP等都明显上调了，在膜脂质组分被改变之后可以减轻乙醇对细胞膜的破坏作用。尽管两株菌共享部分应激响应，如醇脱氢酶，核糖体相关基因上调，碳水代谢通路受到抑制，但核心防御通路完全不同，这也反映了窖泥来源的微生物应对乙醇压力存在多样化的分子机制，也为理解窖泥微生物的耐乙醇表型提供了分子依据。

图3 乙醇胁迫下的菌株特异性转录反应(A-D)植物乳杆菌F4（A，B）和表皮葡萄球菌F5（C，D）在24小时和48小时的差异表达基因（DEG）的火山图红点和蓝点分别表示上调和下调的基因（|log 2光纤通道|≥ 1.2），调整后p ≤ 0.05。（E）保守的单调反应。趋势代表功能类别一致上调（左）或下调的平均log 2 FC（右，例如，（F）菌株特异性胁迫相关的转录谱。与F4中的发酵/氧化还原反应和F5中的脂质/甘油代谢相关的选定基因的表达谱。响应高乙醇胁迫的菌株F4中核心代谢途径的重塑

三、结论

本研究建立了氘代水标记单细胞拉曼光谱和拉曼激活细胞分选【D₂OSCRSRACS】技术平台，并且创建了“先分选，后培养”的代谢驱动筛选模式，在窖泥复杂的微生物群落里找到能够抵抗乙醇的功能性微生物。系统的分选通量可以达到每小时2400个细胞，分选准确率为91.3%，用CDR大于0.08作为筛选标准来富集乙醇胁迫下的代谢活跃度最高的前1%的细胞。和传统的盲筛相比，高耐乙醇菌株富集倍数提高了4.5倍，耐受评估效率也提高了6.86倍

经过筛选得到了六种能够抵抗乙醇的菌株，并且这些菌株的拉曼耐受指数RTI都大于50%，可以忍受8%浓度的乙醇。选择具有代表性的植物乳杆菌F4和表皮葡萄球菌F5进行多组学分析，证明两者在乙醇适应方面存在差异化的途径：F4通过调节发酵途径来保持细胞内的代谢平衡；而F5则依靠脂质合成来加强细胞膜，从分子水平上证实了拉曼分选信号具有生理上的意义。

该平台不需要荧光标记，而是根据单个细胞的实际代谢活性来选择样本，并且可以捕捉到群落里低丰度的功能优良菌株，避免了传统的培养筛选所存在的偏差问题。此技术不但可以用于白酒窖泥中耐乙醇菌种的挖掘上，还可以扩展到耐酸，耐盐等各个领域工业抗逆微生物资源的开发上，给工业功能菌株的大规模筛选提供了一条新的途径。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2026.135397