一种基于生物工程细胞和四通道电极装置的电化学生物传感器

1.引言

食源性致病菌污染严重威胁全球食品安全，开发高效检测技术至关重要。传统检测方法多依赖物种特异性靶标，难以实现广谱致病菌识别。III型分泌系统（T3SS）作为多种革兰氏阴性致病菌共有的保守毒力因子，是理想的广谱检测靶标。以活细胞为识别元件的生物传感器虽具优势，但天然免疫细胞受体谱复杂，交叉反应问题突出。利用合成生物学技术构建工程化细胞，结合三维培养策略，有望实现高特异性与广谱性兼顾的致病菌电化学检测。

本研究开发了基于工程化细胞与四通道电极器件的电化学生物传感器技术，通过慢病毒转染HEK293细胞稳定表达hNAIP-NLRC4复合物构建工程化传感元件，采用蜡印法制备NaAlg@paper三维支架实现细胞快速固定与三维培养，结合四通道金电极器件与差分脉冲伏安法（DPV），解决了传统致病菌检测依赖物种特异性靶标难以广谱识别及天然免疫细胞交叉反应等问题。传感器对鼠伤寒沙门菌线性范围为2.8×10²~2.8×10⁷ CFU/mL，检出限1.7×10² CFU/mL，成功区分致病与非致病大肠杆菌并广谱识别多种T3SS阳性菌，食品样本回收率94.83%~101.7%，具有重要应用价值。

2.结果与讨论

四通道电极器件的构建与组装：四通道电极器件的构建与组装：利用CNC雕刻机精密加工丙烯酸上下层平板并结合光刻镀膜法在B270玻璃基板上制备四通道工作/参比/对电极结构，通过弹簧销式夹具与密封环实现纸基芯片与电极基板的精确对准和机械固定，获得支持四通道并行CV、DPV和EIS测量且无交叉干扰的集成化电化学检测平台。

图 1 四通道电化学探测平台的结构设计与组装。（A）上下亚克力板的尺寸和配置。（B）在B270玻璃基板上制造的四通道金电极的布局和尺寸。（C）上下板和电极基板整合后，完成四通道电极器件的组装。（D） 将四通道电极装置与预制的即用NaAlg@paper支架组装，用于细胞固定。

生物传感器的电化学表征与细胞浓度优化： 生物传感器的逐层组装表征与细胞浓度优化：利用循环伏安法(CV)、差分脉冲伏安法(DPV)和电化学阻抗谱(EIS)三种电化学技术监测从裸金电极到细胞负载电极逐层组装过程中的氧化还原峰电流衰减与阻抗递增现象，证实细胞与水凝胶层的绝缘特性对电子传递的阻碍作用，通过EIS响应-细胞浓度线性关系确定1×10⁶ cells/mL为传感器最佳细胞接种浓度。

图 2 生物传感器的电化学表征。（A） CV，（B） DPV 和 （C） 生物传感器分级制造过程中的 EIS 响应;（a） 裸金电极，（b） 裸纸/金电极，（c） 预制的现成NaAlg@paper支架/金电极;（d） HEK293/hNAIP–NLRC4电池加载NaAlg@paper支架/金电极（C细胞=1 ×10⁴细胞/毫升）。（D）细胞浓度与EIS响应之间的线性回归曲线;插入：在NaAlg@paper支架中固定不同浓度的HEK293/hNAIP–NLRC4细胞时，获得的EIS反应，（a）1 × 10⁷细胞/毫升，（b）1×10⁶细胞/毫升，（c） 1 × 10⁵细胞/毫升，（d） 1 × 10⁴细胞/毫升，（e） 1 × 10³细胞数/mL，（f）1×10²细胞/毫升在2.5 mM Fe（CN）63-/4-.数据以平均值±标准差（SD）表示，n = 3。

鼠伤寒沙门菌的电化学定量检测：鼠伤寒沙门菌的电化学定量检测：利用差分脉冲伏安法(DPV)记录工程化细胞经不同浓度沙门菌刺激后焦亡响应电流的梯度变化，结合LDH释放实验验证细菌浓度依赖性细胞损伤的一致性，实现沙门菌2.8×10²~2.8×10⁷ CFU/mL五数量级线性检测（检出限1.7×10² CFU/mL，R²=0.9954），并通过共聚焦Z轴层扫成像与扫描电镜证实三维支架中细胞的均匀分布及细菌刺激后的细胞破裂现象。

图 3 利用生物传感器检测不同浓度的S. typhimurium。（A） 不同浓度的 S. typhimurium 处理 HEK293/hNAIP-hNLRC4 细胞的 DPV 变化，（a→g） 箭头表示：（a）2.8 × 10⁷ CFU/mL，（b） 2.8 × 106CFU/mL，（c） 2.8 × 105CFU/mL，（d）2.8 × 104CFU/mL，（e）2.8 × 103CFU/mL，（f） 2.8 × 102CFU/mL，（g）2.8 × 101CFU/mL;（B）拟议生物传感器对应于S. typhimurium不同浓度的电流。插图：DPV电流响应与S. typhimurium浓度对数之间的线性校准图。数据以平均值±标准差（SD）表示，n = 3。

细菌刺激前后细胞形态的微观表征：细菌刺激前后细胞形态的微观表征：利用扫描电子显微镜(SEM)对比观察NaAlg@paper三维支架中固定HEK293/hNAIP-NLRC4细胞在未经沙门菌刺激与经沙门菌刺激后的表面形态差异，证实三维培养环境下细胞保持完整形态而细菌刺激后细胞发生破裂解体，从微观形态学角度验证电化学信号增强源于焦亡导致的细胞内容物释放。

图 4 HEK 293/hNAIP-NLRC4细胞在NaAlg@paper支架中固定的SEM图像。（A）未刺激S. typhimurium的HEK 293/hNAIP-NLRC4细胞形态;（B）刺激S. typhimurium后HEK 293/hNAIP-NLRC4细胞的形态学。

基于T3SS的致病菌广谱识别与特异性验证：基于T3SS的致病菌广谱识别与特异性验证：利用差分脉冲伏安法(DPV)检测生物传感器对鼠伤寒沙门菌、弗氏志贺菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7等T3SS阳性菌及金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K12等T3SS阴性菌的响应差异，结合工程化非致病性大肠杆菌K12携带pR995-SPI1质粒后恢复强电流响应的对照实验，证实传感器信号输出由T3SS结构组分而非细菌致病性决定，同时食品基质对照排除非特异性干扰，实现致病性与非致病性大肠杆菌的有效区分及多种T3SS阳性食源性致病菌的广谱识别。

图 5 生物传感器对S. typhimurium（a）、flexneri（b）、EHEC O157：H7（c）、金黄色葡萄球菌（D）、大肠杆菌K12（e）、基质对照（f）、大肠杆菌K12-SPI1（g）和空白对照（h）的DPV反应。每种细菌的浓度为2.8×107CFU/毫升。数据以平均值±标准差（SD）表示，n = 3。

3.总结

本研究开发的电化学生物传感器具有多重优势：一是采用工程化HEK293/hNAIP-NLRC4细胞作为识别元件，靶向保守毒力因子T3SS，突破了传统方法依赖物种特异性靶标的局限，实现了对多种革兰氏阴性致病菌的广谱识别；二是蜡印法制备的NaAlg@paper三维支架操作简便、成本低廉，可实现细胞的快速固定与高效培养；三是四通道电极器件设计巧妙，支持平行并行检测，显著提升检测通量与效率；四是传感器检出限低至1.7×10² CFU/mL，线性范围宽达五个数量级，并能有效区分致病与非致病大肠杆菌，在人工污染食品样本中回收率达94.83%~101.7%，展现出良好的实际应用前景。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2026.140548