无酶双荧光适体传感器实现艰难梭菌RNase H2灵敏检测

艰难梭菌是一种能够形成芽孢的厌氧细菌，与抗生素相关腹泻和伪膜性结肠炎密切相关。其芽孢可在医疗环境及其他场所持续存在，增加了感染防控的难度。现有检测方法包括产毒培养、细胞毒性中和试验和酶免疫分析等，但部分方法操作较复杂，对检测时间和实验条件也有一定要求。寻找能够识别特定分子标志物的检测技术，因而成为相关研究的方向之一。

本研究选择艰难梭菌RNase H2作为靶标，利用核酸适体实现分子识别。研究人员将熵驱动催化（EDC）与催化发夹组装（CHA）连接，构建无需外源酶参与的核酸信号放大体系，并引入序列工程化DNA模板银纳米簇（DNA-AgNCs）作为荧光探针。银纳米簇的发光受到DNA成核序列及局部碱基环境影响，适合将核酸构象变化转化为荧光信号。研究采用红、黄两个发射通道，目标物存在时红光增强、黄光减弱，利用两种信号的比值进行分析，以减小部分环境波动对单通道检测的影响。

研究内容

图1.磁分离与EDC-CHA级联扩增的可行性验证

磁珠固定的适体结合RNase H2后释放c-Apt，启动EDC-CHA反应。PAGE显示，Apt与c-Apt形成双链（泳道3），加入目标后出现游离c-Apt（泳道4）。EDC复合物在泳道6迁移最慢，加入c-Apt后部分解离（泳道8），与燃料链共同作用后进一步解离（泳道9）。CHA仅在X1存在时形成T1-H-P组装产物（泳道7）。完整体系荧光明显增强（图1G），级联反应约30分钟达到平台，快于单独CHA（图1H）。

图2. DNA-AgNCs的结构表征与发光特性

红光AgNCs与富G序列作用后，粒径由3.69 nm增至7.58 nm（图2A、2B），黄光AgNCs则由6.54 nm减至4.82 nm（图2D、2E）。高分辨电镜观察到0.236 nm的晶格间距（图2C、2F）。XPS检出DNA模板相关元素及Ag(0)、Ag(I)（图2G、2H）。红光簇在554 nm激发下于622 nm发射，黄光簇在496 nm激发下于570 nm发射（图2I），为双通道检测提供了条件。

图3.双模式荧光响应与稳定性

CHA触发发夹构象改变，使富G序列靠近银纳米簇，红光增强、黄光减弱（图3A）。图3B、3C展示了两种探针的发光特征。在25℃下储存28天，增强型红光AgNCs荧光基本稳定，未增强黄光AgNCs的强度下降33.99%（图3D）。两种浓度下的批次重复性试验中，RSD均低于6%（图3E、3F）。图3G进一步显示了双通道的反向响应，为利用荧光比值减小部分信号波动提供了依据。

图4.双荧光适体传感器的分析性能

随着RNase H2浓度增加，红光逐渐增强，黄光则减弱（图4A、4B）。研究人员采用Gompertz函数拟合非对称比率响应，原稿记录的0.01～19.95 nmol/L区间内，拟合决定系数R²为0.997（图4C）。图4D至4F比较了不同荧光模式，其中黄光通道的线性范围记为0.01～100 nmol/L。论文报告的检测限为9.27 pg/mL，公开摘要给出的检测范围为0.01～100 ng/mL。

图5. 传感器对艰难梭菌RNase H2的特异性验证

研究人员将RNase H2与大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、宋内志贺菌、肠道沙门菌和金黄色葡萄球菌的裂解液分别进行检测。图5显示，目标蛋白产生明显的荧光响应，五种非目标细菌裂解液的信号较弱，说明该体系在所测试的对照范围内具有一定选择性。不过，单独检测不同细菌裂解液，尚不能证明传感器在真实混合菌群中具有相同的抗干扰能力。

本研究将适体识别、无酶EDC-CHA级联放大与DNA-AgNCs荧光调控结合，实现了艰难梭菌RNase H2的双通道检测。红光增强与黄光减弱的反向响应，为比率定量提供了依据。在加标河水和阴性粪便样本中，原稿报告的回收率为92.7%～108.3%，重复测定RSD为4.2%～5.1%，说明该体系在所测试的模拟基质中具有一定的定量检测能力。不过，现有结果仍以加标实验为主，缺少真实临床阳性样本及现场检测验证。该方法能否用于实际诊断，还需进一步考察复杂样本中的干扰、检测流程及结果可靠性。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2026.139533