自催化核酸电路助力双病原菌同步检测

食品中可能同时存在多种致病菌，只检测其中一种，难以全面了解样品的微生物污染情况。鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌都是食品安全监测中的常见目标。传统培养法需要等待菌落生长，PCR虽然能识别特定核酸序列，却涉及扩增反应和相应设备。要在一次检测中区分两种细菌，还得解决不同靶标之间的信号干扰问题。

研究人员将目光转向嗜热菌Argonaute蛋白TtAgo。它能够在短链向导DNA的引导下识别并切割靶DNA，不依赖特定的PAM序列。研究利用切割产物继续启动后续反应，构建自催化核酸电路，在不预先扩增靶DNA的条件下放大识别信号。读数部分采用两种编码表面增强拉曼散射标签，让不同病原菌对应不同的光谱特征。不过，两种标签的谱峰仍可能相互影响，单看某个峰的强度未必能准确推算混合样本中的菌量。为此，研究还引入机器学习，利用完整拉曼谱图分别估算两种目标菌的浓度。

研究内容

图1.自催化核酸电路的设计与信号转换

TtAgo在向导DNA引导下切割靶序列，产生T1；T1继续引导TtAgo切割拉曼探针表面的报告DNA，释放T2。T2又参与反应模板RC的切割，生成新的T1，使反应循环进行。目标存在时，更多拉曼探针留在磁分离后的上清液中，信号随之增强。两种探针分别采用MBA和DTNB作为拉曼报告分子，以便识别不同靶标。

图2.金银核壳拉曼标签的制备与表征

电镜显示，包壳后颗粒粒径约33 nm，金壳平均厚度约1.5 nm；元素映射可见银集中于内部，金分布在外层。随着报告分子修饰和金壳形成，颗粒的紫外可见吸收峰由400 nm依次移至414 nm和436 nm。XPS中银3d与金4f的特征峰也支持金属银核、金壳结构的形成。

图3.编码拉曼标签的信号增强与稳定性

两种标签分别选取1586 cm⁻¹和1304 cm⁻¹作为MBA、DTNB的主要读数位置。实验确定MBA浓度为1 mmol/L、DTNB浓度为4 mmol/L时，信号较强且颗粒未见明显聚集。金壳形成后，MBA标签的SERS增强因子约为1.30×10⁶，高于未包壳银颗粒的7.22×10⁵。模拟结果显示，较强的局部电磁场集中在核壳间隙。MBA标签在室温放置30天后仍保留约93%的初始信号，85℃加热2小时后也未见明显变化。

图4.自催化反应的验证与条件优化

完整体系在凝胶上出现明显的切割产物，缺少反应模板RC时，拉曼信号则较弱。调整探针表面的DNA负载量后，报告DNA与polyT的体积比为1∶30时信号变化最大，每个颗粒平均连接约49条报告DNA。后续实验选用200 nmol/L TtAgo、400 nmol/L RC，反应90分钟后读取信号。酶和模板的用量继续增加，并未带来更高的响应。

图5.两种病原菌的定量检测

单靶检测时，两种细菌在10²～10⁸ CFU/mL范围内均呈现良好的对数线性响应，鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测限分别为2.4和2.5 CFU/mL。双靶同步检测时，两者的检测限分别为1.7和2.7 CFU/mL，对应的线性范围为10²～10⁸ CFU/mL和10³～10⁸ CFU/mL。以单核细胞增生李斯特菌、阪崎肠杆菌和大肠埃希氏菌为对照，在所测试的10⁶ CFU/mL条件下，非目标菌未产生明显的特异性响应。

SAANC利用TtAgo切割产物驱动后续反应，在不预先扩增靶DNA的情况下放大检测信号，并借助两种拉曼标签区分鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。实验显示，双靶检测的信号会相互影响，利用完整光谱建立PLSR模型后，菌量预测有所改善。食品样品中的检测与回收结果也支持该方法继续开展应用研究。不过，TtAgo反应仍需约85℃的高温条件，平台还依赖拉曼采集设备和光谱分析流程。现有食品验证的规模较小，尚不足以说明其已适合现场常规筛查。后续需要在更广泛的真实样品中检验检测性能，并评估高温反应和仪器配置对实际操作的影响。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6c03958