重力磁控芯片实现食源性病原体检测

食品中的病原菌含量较低时，检测前通常需要完成样品处理和核酸提取。传统培养法等待时间较长，PCR则需要配套的扩增仪器。环介导等温扩增（LAMP）可以在恒定温度下完成核酸扩增，但如果前期仍需反复移液、洗涤和转移样品，整个检测流程就很难进一步简化。已有微流控装置能够集成部分操作，不过，多步液体处理往往需要外部泵阀或多个驱动部件配合。

这项研究将液体输送和磁珠移动分开处理。重力介导磁控微流控芯片（GMMC）只设一条蛇形通道，裂解样本、两级洗涤液和洗脱液从不同位置加入，由矿物油隔成独立液段。试剂留在各自的区域，磁珠则在外部磁铁牵引下依次经过这些液段，完成DNA结合、洗涤和洗脱。获得的DNA用于实时荧光环介导等温扩增（qLAMP），分别检测肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌O157:H7和金黄色葡萄球菌。芯片不需要输液泵阀，磁珠移动由单台电机控制，扩增与荧光读数则由配套设备完成。

研究内容

图1.单通道微流控检测装置的设计

整套装置由GMMC芯片、磁控机构和上位机软件组成。GMMC芯片采用ELEGOO Saturn 4 Ultra进行3D打印，高40 mm、底边长120 mm、厚4 mm。蛇形通道上设有独立加样口，裂解样本、两级洗涤液和洗脱液从不同位置注入，却都留在同一条通道内。芯片下方的圆柱磁铁负责牵引磁珠，磁铁的运动由一台配有150 mm丝杠的闭环步进电机控制。滑块沿X轴移动时，曲线槽带动磁铁改变Y轴位置，使磁珠能够沿通道依次经过各个试剂区。磁控设备通过RS-485协议与计算机连接，操作由上位机软件控制。

图2.芯片内的磁珠转移与DNA洗脱

矿物油与水相液体在重力和界面张力作用下保持分隔，样本及各级处理液不必在检测过程中反复更换。磁珠预先与裂解样本混合，磁铁先以10 mm/s扫过样本区，使磁珠聚集；进入洗涤阶段后，移动速度降至0.5 mm/s。磁珠穿过两级洗涤区，在洗脱区停留1分钟。最后，磁铁向左偏移约10 mm，带走磁珠，洗脱得到的DNA则留在通道末端，供后续扩增使用。

图3.磁控机构与转移速度优化

研究以末端洗脱区的磁珠积分密度比较不同传输速度。当速度超过约2.5 mm/s时，到达末端的磁珠减少；采用0.5 mm/s时，磁珠保留量较高，重复测试的结果也较为稳定。COMSOL仿真得到磁铁中心上方0.5 mm处的磁场强度约为3.70×10⁵ A/m，磁体表面磁感应强度为1669 G。初始体积为5、10和20 μL的磁珠悬液均完成了跨液段转移。

图4.DNA提取性能与qLAMP条件优化

以1×10⁵ CFU/mL的肠炎沙门氏菌样本比较两种提取方式，芯片法与传统管式磁珠法所得DNA的qPCR扩增曲线和Cq值接近，差异未达到统计学显著水平。芯片提取物的A260/A280比值略低，但在本次实验中未明显影响后续扩增。随后调整qLAMP反应条件，PrimerMix用量为0.5 μL时，扩增阈值时间较短。加入2.0 μL盐酸胍（GuHCl）后，扩增启动约提前3～4分钟；继续增加用量则出现抑制。温度测试覆盖58～69℃，最终采用68℃进行后续检测。

图5.三种食源性病原体的检测性能

在10¹～10⁶ copies/μL的标准品浓度范围内，肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌O157:H7和金黄色葡萄球菌均获得了随DNA浓度变化的扩增信号，校准曲线的R²分别为0.9701、0.9627和0.9610。三种靶标的检测限均为10 copies，在这一水平重复检测时，阳性检出率依次为100%、95%和95%。荧光假单胞菌、单核细胞增生李斯特菌及阴性对照未出现明显扩增。

本平台保留了磁珠提取DNA所需的结合、洗涤和洗脱步骤，但改变了各步骤之间的转移方式。试剂预先分布在单通道内，磁珠沿指定路线移动，减少了反复移液与管间转移。结合qLAMP后，研究在加标鸡肉上清和植物基肉上清中完成了三种食源性病原菌的检测，报告的全流程时间约为50分钟，检测限为10 copies，平均回收率约101%。目前，芯片的自动化主要体现在DNA提取环节。后续扩增仍需要温控和实时荧光读取设备，相关性能也主要在加标食品样品中得到验证。对于成分差异较大的食品，样品裂解、磁珠提取和扩增反应能否保持相同表现，还需要更多实际样品数据支持。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6c02048