DNA 双链定向固定抗体，电化学平台覆盖三类临床蛋白标志物

蛋白质标志物广泛参与肿瘤、炎症、心血管疾病和感染性疾病的早期诊断、治疗监测与预后评估。传统 ELISA、免疫荧光、免疫印迹和 Western blot 等方法具有较好的特异性，但在实际临床场景中往往需要较长检测时间、专用仪器和专业人员。电化学免疫传感器能够把抗原-抗体识别事件转换为可测电信号，具有易小型化、成本较低和便于集成等特点。不过，捕获抗体如何固定在电极表面，仍会直接影响识别位点的可用性、传感器的灵敏度和批间稳定性。

常规物理吸附难以控制抗体在界面的方向和密度，可能使部分结合位点朝向电极表面而失去活性；部分有序单分子层虽然能够提供较规则的固定位置，却可能增加抗体之间的空间位阻，并对蛋白分子造成不利的界面环境。本研究的思路是把捕获抗体先连接到 DNA 单链，再利用另一条固定在金电极上的互补 DNA 链，通过碱基配对把抗体锚定到界面。研究人员将这一 DNA 工程化固定策略用于构建 DEISP，并选择 NGAL、IL-6 和 cTnI 三类临床蛋白作为示范靶标。

图1. DEISP 检测蛋白质标志物的工作机制示意图。（a）从患者获得临床血液和尿液样本用于诊断检测；（b）通过互补双链 DNA 杂交，将 DNA 工程化捕获抗体固定在传感界面；（c）目标蛋白被识别并捕获，随后与 HRP 标记的检测抗体形成夹心结构。

DEISP 的工作过程包括捕获和信号转导两个环节。金电极表面先固定 DNA-抗体复合物，临床样品中的目标蛋白被捕获后，再由 HRP 标记的检测抗体结合，形成夹心型免疫复合物。电极浸入含有过氧化氢和四甲基联苯胺（TMB）的体系后，HRP 催化氧化还原反应，生成蓝色产物并产生可记录的电流信号。由于捕获抗体通过 DNA 双链固定，研究人员可以在保持界面稳定的同时，减少随机吸附造成的识别位点损失。

构建结果显示，针对 NGAL、IL-6 和 cTnI 的抗体组合均能形成明显的靶标结合信号。DNA-S1 与固定在金电极上的 DNA-S2 能够有效杂交，计算得到的杂交自由能为 −27.3 kcal/mol。经化学偶联和纯化后，捕获抗体-DNA 复合物形成了较高纯度的目标组分。与物理吸附的捕获抗体相比，DNA 工程化抗体在相同靶标浓度下带来的电流变化分别提高到空白对照的 5.6 倍、6.1 倍和 8.2 倍，而物理吸附方式分别为 2.7 倍、4.3 倍和 5.3 倍，说明定向固定有助于保留抗体活性。

图2. DEISP 的有效性分析与参数优化。（a）DNA 工程化捕获抗体示意图；（b）物理吸附捕获抗体示意图；（c）NGAL、（d）IL-6 和（e）cTnI 在 DNA 工程化捕获抗体或物理吸附捕获抗体条件下的电流信号；（f）目标蛋白孵育时间；（g）Ab2-HRP 孵育时间；（h）Ab1-S1 孵育浓度；（i）Ab2-HRP 孵育浓度。

参数优化表明，20 bp 的随机双链 DNA 在稳定性和界面距离之间取得了较好平衡。DNA-S2 浓度增加后，信号在 1 μM 左右趋于平台；DNA 过短会降低热稳定性，过长则可能使抗体距离电极过远。目标蛋白和 HRP 标记检测抗体的孵育时间分别选择 60 分钟和 30 分钟，总检测时间约为 90 分钟。值得注意的是，目标蛋白、捕获抗体-DNA 复合物和检测抗体的用量均为 5 μL，低于常规 ELISA 常用的 100 μL 级样本体积，有助于减少样本消耗。

在分析性能测试中，三类目标蛋白浓度升高均伴随电流信号增加。NGAL 的检出限为 0.025 pg/mL（1 fM），IL-6 为 0.026 pg/mL（1 fM），cTnI 为 2.35 pg/mL（100 fM）。对应的动态范围分别覆盖 1 fM–1 nM、1 fM–1 nM 和 100 fM–10 nM，跨越约 6–7 个数量级，三类标志物的线性拟合决定系数均高于 0.9。与文中比较的常规 ELISA 试剂盒相比，NGAL 和 IL-6 的检测灵敏度提高约 2–3 个数量级。对于 cTnI，平台的线性范围覆盖接近临床 99% 参考上限的浓度区间，也覆盖更高的围手术期心肌损伤相关水平。

图3. DEISP 的分析性能评价。（a）NGAL、（b）IL-6 和（c）cTnI 的安培法 i-t 曲线；（d）NGAL、（e）IL-6 和（f）cTnI 的检出限；（g）NGAL、（h）IL-6 和（i）cTnI 的动态范围。NGAL 和 IL-6 的标准品范围为 1 fM 至 1 nM，cTnI 的标准品范围为 100 fM 至 10 nM。

研究人员还考察了潜在干扰蛋白的影响。加入卵清蛋白、牛血清白蛋白和血红蛋白后，电流信号与空白组相比没有显著差异，而 NGAL 组出现明显响应，说明在该实验条件下，DEISP 对目标蛋白具有较好的选择性。传感器的批内相对标准偏差为 4.42%，批间相对标准偏差为 6.2%；在 4 ℃ 保存 10 天后，仍保留初始响应的 87.8%。这些结果表明，DNA 固定界面不仅改善了初始信号，也为重复使用同类界面提供了稳定性基础。

临床样本验证以 NGAL 为示范目标。研究共分析了 15 份血清样本和 7 份尿液样本，样本来自健康人群和肾损伤患者。DEISP 能够区分正常组与肾损伤组，且与 ELISA 的检测结果在统计学上没有显著差异；两种方法的检测值相关系数分别为 0.83 和 0.78。以临床金标准诊断为参照，DEISP 的灵敏度为 90.0%，特异性为 91.7%，精确率为 90.0%，总体准确率为 90.9%。

图4. DEISP 在临床样本检测中的性能评价。（a）NGAL 检测工作原理示意图；（b）DEISP 测得的血清 NGAL 浓度；（c）ELISA 测得的血清 NGAL 浓度；（d）NGAL 定量分析的小提琴图；（e）15 份临床血清样本中 DEISP 与 ELISA 测得的 NGAL 水平热图；（f）7 份临床尿液样本中 DEISP 与 ELISA 测得的 NGAL 水平热图；（g）DEISP 结果与临床诊断比较的混淆矩阵；（h）NGAL 和 IL-6 的检出限与既往研究比较；（i）DEISP 与其他三种策略在六项综合性能指标上的雷达图。

总体来看，DEISP 的主要改进并不只是把检测限进一步降低，而是把捕获抗体在界面上的固定方式变成了可设计、可调节的 DNA 杂交模块。该模块可以通过更换目标抗体和检测抗体，扩展到不同蛋白标志物；同时，较小的样本体积和相对简化的操作流程，为多标志物筛查和便携式检测提供了技术基础。不过，当前临床验证样本量为 22 份，且临床样本验证集中于 NGAL；平台能否在更大规模、多中心和不同疾病人群中保持准确性，还需要进一步研究。因此，本文结果支持其作为临床蛋白标志物检测和 POCT 开发的候选平台，但不能直接等同于已经完成临床诊断替代验证。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118485