无血清悬浮培养技术实现蚊细胞生物反应器高效扩增乌苏图病毒

登革热、寨卡、西尼罗河热等蚊媒病毒持续在全球扩散，给公共卫生带来巨大压力。近年来，基于昆虫特异性病毒构建的新型嵌合疫苗受到广泛关注，这类疫苗能够在蚊细胞中高效复制，但在哺乳动物细胞中受到明显限制，因此具有较高的安全性。然而，目前大多数蚊细胞仍依赖贴壁培养方式，存在培养面积受限、操作繁琐和放大困难等问题，严重制约了工业化生产。针对这一瓶颈，荷兰瓦赫宁根大学研究团队建立了无血清悬浮培养体系，并将其成功扩展至搅拌罐生物反应器，实现了蚊细胞的大规模扩增和病毒高效生产。研究发表于 Scientific Reports。

研究团队选择来源于伊蚊的两种经典细胞系 C6/36 和 U4.4，采用化学成分明确的 EX-CELL 培养基进行无血清悬浮驯化。结果表明，两种细胞均能较快适应悬浮条件，在摇瓶中达到 1×10⁷ cells/mL 以上 的高细胞密度。其中 C6/36 的最高细胞浓度达到 1.90×10⁷ cells/mL，倍增时间约 40 h；U4.4 的最高浓度达到 1.15×10⁷ cells/mL，倍增时间约 45 h。冻存复苏后，C6/36 细胞仅经过两代培养即可恢复稳定生长，说明该体系具有良好的稳定性和可重复性。

在完成摇瓶驯化后，研究人员进一步将 C6/36 细胞转移至 500 mL 搅拌罐生物反应器（STR）。两次独立实验均获得与摇瓶相近的生长动力学，其中第一批次最终细胞浓度达到 1.3×10⁷ cells/mL，倍增时间约 36 h，培养末期细胞活率仍保持在 80% 以上。这一结果证明蚊细胞能够在受控搅拌条件下稳定悬浮生长，是实现规模化培养的重要一步。

为了验证该平台的病毒生产能力，研究团队以乌苏图病毒（Usutu virus，USUV）为模型进行感染实验。USUV 是一种蚊媒黄病毒，与西尼罗河病毒和日本脑炎病毒亲缘关系较近。结果显示，在生物反应器中感染的 C6/36 细胞可产生 超过3.6×10⁸ TCID₅₀/mL 的病毒滴度，最高达到 6.32×10⁸ TCID₅₀/mL，与传统贴壁培养获得的高滴度水平相当。尽管感染后细胞增殖受到一定抑制，但病毒复制动力学总体稳定，表明该悬浮体系能够有效支持黄病毒的大规模生产。

图1 搅拌反应器与摇瓶培养体系下 C6/36 细胞密度、活力及病毒滴度时序变化曲线

C6/36 蚊细胞在无血清悬浮条件下感染乌苏图病毒后，可在搅拌罐生物反应器中产生高滴度病毒，显示出良好的规模化生产潜力。

研究人员还发现，EX-CELL 无血清培养基对病毒复制具有积极影响。在贴壁培养条件下，C6/36 细胞在 EX-CELL 培养基中的病毒产量比传统 L-15 培养基提高 100 倍以上，说明培养基组成对黄病毒复制具有重要调控作用。作者推测，去除血清后可能减少了病毒与宿主细胞受体结合的干扰，从而提高感染效率。

论文最后指出，这是首次报道 C6/36 蚊细胞在化学成分明确、无血清条件下实现搅拌罐生物反应器悬浮培养，并成功用于黄病毒生产。该平台有望应用于昆虫特异性病毒嵌合疫苗、减毒虫媒病毒疫苗、病毒抗原诊断制品以及蚊媒生物防控病毒等多种产品的开发与制造。研究团队认为，随着培养参数进一步优化，蚊细胞悬浮生物反应器技术有望成为新一代虫媒病毒疫苗工业化生产的重要基础平台。

参考来源：Kenbeek D, Kanters J, Bousnina K, Schrama M, Martens DE, Fros JJ. Suspension cultivation of mosquito cell lines for the production of the mosquito-borne flavivirus Usutu virus in a stirred-tank bioreactor. Sci Rep. 2026 Jan 9;16(1):3742. doi: 10.1038/s41598-025-33792-z. PMID: 41507313; PMCID: PMC12852204.