文献解读｜打破前体瓶颈！过表达 acl 基因，显著提升灵芝酸（GAs）产量

原创

来源：黄丽雅

2026-09-24 16:49:59

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核心提示：该研究在灵芝中过表达acl（ATP‑柠檬酸裂解酶）基因，提升胞内乙酰 - CoA 前体供给，上调 MVA 合成通路关键基因，在液体摇瓶、甘蔗渣固态发酵两种体系下均显著提高各类灵芝酸产量，固态发酵增产效果更突出，为构建高产灵芝酸基因工程菌株提供了新靶点。

灵芝（Ganoderma lingzhi）是传统名贵药用真菌，在东亚国家已有两千多年药用历史。灵芝酸（GAs）作为羊毛甾烷型三萜活性物质，具备抗肿瘤、抑制肿瘤转移、抗病毒等药理活性，是灵芝核心功能成分。灵芝酸属于四环三萜，不同单体药理功能各有侧重：GA-T 诱导肺癌转移细胞凋亡；GA-Me 抑制肺癌细胞侵袭转移；GA-S、GA-Mk 可诱导宫颈癌 HeLa 细胞凋亡。如今，市场对灵芝酸需求日益提高，因此通过发酵+基因工程手段创制高灵芝酸产量菌株，提升工业上灵芝酸产量具有重要意义。

如何通过代谢工程提高灵芝酸产量，一直是药用真菌研究的热点。过往大量研究聚焦改造灵芝酸合成通路中下游基因，很少关注上游前体物质乙酰-CoA 的供给瓶颈。2026年6月，Wang zixu等人在《Molecular Biotechnology》发布了题为“Overexpression of the ATP-Citrate Lyase Gene Enhances Ganoderic Acid Biosynthesis in Ganoderma lingzhi”的研究性论文，文章通过在灵芝中克隆并过表达acl（ATP-柠檬酸裂解酶）基因，分别对比液体摇瓶、甘蔗渣固态发酵（SSF）两种模式，证实强化乙酰-CoA 供给，可以显著拉动整个 MVA 代谢通路，实现灵芝酸大幅增产，为灵芝高产细胞工厂构建提供全新方向。

一、核心研究结果

1.1 acl 基因与过表达菌株验证

灵芝acl基因全长 4116 bp，ORF 阅读框 3468 bp，编码 1156 个氨基酸，蛋白分子量 125.59 kDa。蛋白含有 ATP-柠檬酸裂解酶、柠檬酸结合保守结构域，与其他担子菌 ACL 蛋白同源性很高（图1）。本文章通过固态发酵（SSF）过表达菌株第6、12、18 天，测定菌株中acl表达量，结果表明，发酵第12天时表达量最高，是野生型的12.64 倍（图2 d）。

图1 acl基因扩增及氨基酸序列

图2 过表达载体构建及转化子验证

1.2 液体摇瓶发酵：过表达显著提升灵芝酸产量

对3株过表达菌株及野生型进行液体摇瓶发酵，实验结果表明，过表达 acl 不会显著影响灵芝菌丝生长，过表达菌株生物量与野生型无显著差异（表1），ACL1过表达菌株总灵芝酸最高可达 1.91 mg/100 mg DW，是野生株（1.05 mg/100 mg DW）的1.73 倍。四种单体灵芝酸最大含量对比野生型提升倍数： GA-Mk：2.02 倍；GA-T：2.24 倍；GA-S：2.16 倍；GA-Me：1.67 倍。

表1 不同菌株中GA-Mk、GA-T、GA-S和GA-Me的最大含量

图3 液体振荡培养过程中菌丝生长及不同单体GA含量变化

1.3 甘蔗渣固态发酵（SSF）：增产效果更加突出

为了进一步研究acl过表达对GA产量的影响，研究人员进一步用用甘蔗渣评估了SSF发酵过程中WT和ACL菌株中GAs的水平。实验结果表明，随着发酵时间的增长，GA-k 在第 12 天达到峰值；GA-T、GA-S、GA-Me 在第 30 天才到达最高水平。且固态发酵条件下，灵芝酸绝对产量远高于液体摇瓶，acl 过表达增产优势进一步放大。

图4 SSF培养过程中菌丝生长及不同单体GA含量变化

1.4 acl过表达对SSF培养中ATP-柠檬酸裂解酶活性及乙酰辅酶A积累的影响

acl基因编码的ACL蛋白可激活ATP-柠檬酸裂解酶的活性，并生成乙酰辅酶A。为探究过表达acl的菌株中GA生物合成的潜在机制，本研究对不同发酵天数的野生型（WT）和ACL菌株的ATP-柠檬酸裂解酶活性及乙酰辅酶A积累量进行了检测。ACL菌株与WT菌株的ACL酶活性变化趋势相似，均在第18天达到峰值，第18天后酶活性逐渐下降，直至发酵结束，过表达菌株的峰值是野生型的2.08倍（图5 a）。而两种菌株的乙酰辅酶A积累量呈持续上升，直至第30天达到峰值。相比之下，ACL菌株的乙酰辅酶A峰值是野生型菌株的2.82倍（图5 b）。证明过表达acl提高 ACL 酶活，解除上游限制，大幅度增加胞内乙酰-CoA（三萜合成直接前体）。

图5 ATP-柠檬酸裂解酶活性（a）和乙酰辅酶A积累量（b）的时间变化曲线。

1.5 acl 过表达对固态发酵中灵芝酸生物合成的影响

先前的研究表明，GA积累的增加与生物合成基因表达的增加密切相关。因此，分析了ACL菌株和野生型（WT）菌株中hmgr、sqs和ls基因的相对表达水平。如图6所示，acl过表达后，MVA 通路关键基因全部显著上调： hmgr最高上调 3.46 倍，sqs最高上调 7.21 倍，ls最高上调 5.85 倍。通路中间代谢物鲨烯、羊毛甾醇，相比野生株分别提升 1.77 倍、1.54 倍。发酵过程中，ACL菌株中hmgr、sqs和ls基因的表达水平均高于野生型（WT）菌株，表明在灵芝中acl基因的过表达刺激了hmgr、sqs和ls基因的表达。本研究结果表明，灵芝酸（GA）生物合成途径上游基因的遗传操作可能会影响灵芝中下游基因的表达。