核心提示：肠道病毒，如轮状病毒、诺如病毒和星状病毒等一直被认为通过粪-口途径在人群中传播：病毒从一个宿主的粪便进入另一个宿主的口腔，绕过唾液腺(SGs)到达肠道进行复制，然后通过粪便排出并重复此传播周期。
摘要：肠道病毒，如轮状病毒、诺如病毒和星状病毒等一直被认为通过粪-口途径在人群中传播：病毒从一个宿主的粪便进入另一个宿主的口腔，绕过唾液腺(SGs)到达肠道进行复制，然后通过粪便排出并重复此传播周期。然而，有一些病毒(例如狂犬病毒)通过感染SGs使口腔成为其复制场所，唾液成为传播渠道。研究发现肠道病毒可以高效并持久地感染SGs，并将肠道病毒释放到唾液中，确定了病毒传播的第二条途径，这对指导肠道病毒的防护具有重要意义。
背景：唾液是抵御许多通过口腔途径进入宿主病原体的第一道防线。唾液检测常用于诊断几种可感染唾液腺SGs的病毒，如狂犬病毒、单纯疱疹病毒以及严重急性呼吸综合征冠状病毒。在有症状和无症状个体的唾液中经常可以检测到诺如病毒、轮状病毒和星状病毒基因组，但由于这些肠道病毒主要通过粪-口途径传播，如摄入受污染的食物和水等，并在肠道中产生复制，因此这些结果都被解释为肠道污染物。
通过给幼鼠口服鼠源诺如病毒(MNV-1)或轮状病毒(幼鼠流行性腹泻EDIM)，利用TCID50或定量PCR测定病毒滴度。在幼鼠肠道中均检测到MNV-1(图 1b)和EDIM(图1c)的复制，两种病毒在接种后(dpi)3至5天达到峰值，并在7-10天清除。幼鼠通过母鼠哺乳获得关键的免疫成分，如分泌性免疫球蛋白A(SIgA)。幼鼠小肠sIgA水平从MNV-1或EDIM的3 dpi开始迅速上升(图1d)，这与母鼠乳汁SIgA水平的峰值相关(图1e)。分离母鼠乳腺时发现MNV-1和EDIM基因组RNA丰度比输入时增加了大约105倍，表明乳腺存在肠道病毒复制(图1f)。用抗EDIM和MNV-1非结构蛋白NSP5和NS4抗体分别对母鼠乳腺进行免疫染色，确定乳管内的上皮细胞(图1g，h，k，l)和B细胞(图1i，j，m，n)是EDIM和MNV-1的复制部位。
用EDIM口服接种产后10天抗EDIM血清呈阴性的母鼠(图1o)，并测定了乳腺和小肠中EDIM基因组RNA水平(图1p)和乳汁SIgA水平(图1q)，与哺乳受感染幼鼠的母鼠相比(图1d-f)，口服接种母鼠的乳汁中没有SIgA激增(图1q);它们的乳腺也未检测到病毒RNA(图1p)，而它们的小肠中的病毒RNA在4dpi增加了106倍(图1p)。为了进一步研究这种病毒传播模式，给幼鼠口服接种EDIM(幼鼠A)，然后给母鼠(母鼠A)哺乳。在1dpi时，将母鼠A换成一笼未接种病毒的幼鼠(幼鼠B)的母亲(母鼠B)。然后母鼠A哺乳幼鼠B，而幼鼠A由母鼠B哺乳(图1r)。在3dpi时，母鼠A和B的乳腺中的病毒基因组水平都增加了104倍(图1s，而幼鼠A和B的小肠中的基因组水平(图1t)比输入时(大约每毫克组织102个基因组拷贝)增加了106倍。这些结果表明，肠道病毒通过哺乳从幼鼠回流到母鼠的乳腺，导致乳腺感染，并快速触发乳汁sIgA分泌增加
Fig1. 哺乳受感染的幼鼠直接将肠道病毒传到母鼠的乳腺
为了测试肠道病毒是否是通过肠道传播到母鼠乳腺的，从EDIM或MNV-1口服接种的成年小鼠身上提取唾液(因为这比从幼鼠身上提取唾液更容易)(图2a)，用抗EDIM轮状病毒VP6(图2b)和抗MNV-1 VP1(图2c)进行WB发现两种病毒都从2dpi开始在唾液中均可检测到;MNV-1 TCID50测定显示，在3dpi时的滴度比输入(接种后6小时(hpi))高约104倍(图2d)。而MNV-1和EDIM感染是急性的，在7-10dpi内就会消失(图1b，c)。据报道，MNV-3、MNV-4和WU23小鼠诺如病毒株持续感染近端结肠并排入粪便22-25周。作者用这些毒株接种小鼠，发现它们在接种后至少3周内都持续在唾液中存在，滴度大约是输入(6hpi)的103倍(图2e)。在用MNV-1、MNV-3、MNV-4 或WU23毒株口服接种幼鼠和成鼠后，在下颌下腺(SMG)中检测到每种病毒都比输入时(6 hpi)的滴度增加了大约104倍(图 2g，h，k)。在EDIM和鼠星状病毒接种小鼠的SMG中，分别检测到病毒基因组拷贝增加了大约105倍和103 倍(图2i，j )。其中，MNV-3、MNV-4和WU23的SMG病毒复制时间与近端结肠的水平相当(图2l-n)。
Fig2. 肠道病毒在SGs中复制并通过唾液传播
TCID5测定显示MNV-1 滴度在CD45+免疫细胞和EpCAM+(上皮细胞粘附分子)上皮细胞群中显著升高(图3a、b)。通过针对MNV-1复制报告基因NS4免疫染色得到证实(图3c-f)。NS4染色定位于腺泡上皮细胞(图3f，g)。EDIM在CD45+和EpCAM+细胞群中也检测到复制(图 3h)，但后者的复制主要在导管上皮细胞中(图3g、i、j)。编码所有已知的小鼠诺如病毒肠道受体的CD300lf，在SMG EpCAM+和CD45+细胞群中也高度表达(图3k)。给无CD300lf 的幼鼠接种MNV-1没有任何SGs感染(图3l)，这表明CD300lf受体在小鼠诺如病毒感染中是必不可少的。值得注意的是，在口服MNV-1之前，从部分成年小鼠身上摘除SGs可以更快地清除肠道感染(图3m)。
Fig.3 鼠源诺如病毒和轮状病毒在SMG的上皮细胞和免疫细胞中复制
在接种EDIM的腺体细胞微球中，检测到EDIM基因组RNA拷贝在12hpi到48hpi之间增加了10倍(图4a，b)。MNV-1接种后观察到了对2-CMC敏感的复制(图4C)和MNV-1在48hpi(图4D)进入到培养上清。对于人源诺如病毒HuNoV能否在人SG细胞系中复制，将一定体积的HuNoV粪便滤液(图4e)接种于唾液细胞系NS-SV-TT-DC(导管)细胞，在6hpi时洗掉。洗涤后每隔一段时间收集P0代细胞裂解物与抗衣壳VP1和聚合酶NS7的抗体进行WB，结果这两种蛋白都随时间有所增加，表明存在复制(图4f)。将HuNoV在NS-SV-TT-DC细胞中连续传代四次，在96hpi收集细胞裂解物或上清液测定HuNoV的基因组拷贝(图4g，h)。在6到96 hpi之间大约增加了1000倍。虽然P4代复制已经开始减弱，但复制水平接近于之前报道的肠上皮细胞。
轮状病毒和诺如病毒属于囊泡包裹病毒簇，与游离的粪便病毒(囊泡溶解)相比，囊泡包裹的病毒不受粪便蛋白水解酶和核酸酶的影响，从而更容易引发感染。研究重发现只有囊泡包裹的HuNoV接种物才能在导管和腺泡细胞系中有效复制，定量PCR、病毒非结构蛋白(NS7、NS6)的免疫印迹和单分子荧光原位杂交结果都可以证明这一结论(图4i-n)。
Fig.4 肠道病毒在唾液腺体细胞微球和SG细胞系中复制
该研究揭示了肠道病毒的一种新的重要的传播途径，与公认的粪-口传播方式相比，SGs和唾液可能是一种更重要的传播途径，通过交谈、咳嗽、打喷嚏等均可传播，这对预防通过唾液传播的肠道病毒的诊断以及防控具有重要意义。
参考文献：
Ghosh S, Kumar M, Santiana M, et al. Enteric viruses replicate in salivary glands and infect through saliva[J]. Nature, 2022, 607(7918): 345-350.
